前 言
本标准遵循GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的编写规则。
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。
本标准由国家粮食质量监督检验中心归口。
本标准起草单位：国家粮食质量监督检验中心，大连市产品质量监督检验所。
本标准主要起草人：潘炜、王春燕、李鹏、董广彬、于利军。
食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法
1范围
本标准适用于食品中苏丹红染料的检测。
本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法。
方法最低检测限：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ均为10ug/kg。
2术语和定义
2.1苏丹红
属偶氮系列化工合成染料。
3方法要点
样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱-紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。
4试剂与标准品
4.1乙腈色谱纯
4.2丙酮色谱纯、分析纯
4.3甲酸分析纯
4.4乙醚分析纯
4.5正己烷分析纯
4.6无水硫酸钠分析纯
4.7层析柱管：1cm（内径）×5cm(高)的注射器管。
4.8层析用氧化铝（中性100目～200目）：105℃干燥2h，于干燥器中冷至室温，每100g中
加入2mL水降活，混匀后密封，放置12h后使用。
注：不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1ug/mL的苏丹红的混合标准溶液1mL加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60mL完全洗脱为准，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红Ⅲ的回收率偏低时表明活性偏高。
4.9氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10mL正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。
4.105%丙酮的正己烷液：吸取50mL丙酮用正己烷定容至1L。
4.11标准物质：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ；纯度≥95%
4.12标准贮备液：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各10.0mg（按实际含量折算），用乙醚溶解后用正己烷定容至250mL。
5仪器与设备
5.1高效液相色谱仪（配有紫外可见光检测器）
5.2分析天平：感量0.1mg
5.3旋转蒸发仪
5.4均质机
5.5离心机
5.60.45μm有机滤膜
6样品制备
将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需磨细。
7操作方法
7.1样品处理
7.1.1红辣椒粉等粉状样品
称取1g～5g（准确至0.001g）样品于三角瓶中，加入10mL～30mL正己烷，超声5min，过滤，用10mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中（4.9），为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0.5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10mL～30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60mL（4.10）洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0.45μm有机滤膜过滤后待测。
7.1.2红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品
称取0.5g～2g（准确至0.001g）样品于小烧杯中，加入适量正己烷溶解（约1mL～10mL），难溶解的样品可于正己烷中加温溶解。按7.1.1中“慢慢加入到氧化铝层析柱.过滤后待测”操作。
7.1.3辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品
称取10g～20g（准确至0.01g）样品于离心管中，加10mL～20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30mL正己烷：丙酮=3：1，匀浆5min,3000rpm离心10min,吸出正己烷层，于下层再加入20mL×2次正己烷匀浆，离心，合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5分钟，用5mL正己烷溶解残渣后，按7.1.1中“慢慢加入到氧化铝层析柱..过滤后待测”操作。
7.1.4香肠等肉制品
称取粉碎样品10g～20g（准确至0.01g）于三角瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5min，滤出清液，再以20mL×2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5mL以下，按7.1.1中“慢慢加入到氧化铝层析柱中..过滤后待测”操作。
7.2推荐色谱条件
7.2.1仪器条件
色谱柱：ZorbaxSB-C183.5μm4.6mm×150mm（或相当型号色谱柱）
流动相：
.溶剂A0.1%甲酸的水溶液：乙腈=85：15
.溶剂B0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20
梯度洗脱：流速:1mL/min柱温：30℃检测波长：苏丹红Ⅰ478nm；苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、
苏丹红Ⅳ520nm；于苏丹红Ⅰ出峰后切换。进样量10μl。梯度条件见表1。
7.2.2标准曲线
吸取标准储备液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL，用正己烷定容至25mL，此标准系列浓度为0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μg/mL,绘制标准曲线。
7.3计算
按公式（1）计算苏丹红含量
R=C×V/M......（1）
R-样品中苏丹红含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
C-由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V-样液定容体积，单位为毫升（mL）；
M-样品质量，单位为克（g）。
表1梯度条件
流动相
时间（min） A％ B％ 曲线
0 25 75 线性
10.0 25 75 线性
25.0 0 100 线性
32.0 0 100 线性
35.0 25 75 线性
40.0 25 75 线性
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